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      蛋白質紫外吸收與濃度測定

      2022-06-20
      379次

      在蛋白和抗體純化工作中,如何準確的進行定量一直是一個棘手的問題。傳統的方如Bradford,BCA等操作繁瑣,耗時長,而通過測定蛋白質的紫外吸收來定量,則非??焖俜奖?。

      蛋白質擁有的紫外吸收性質是來自芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸分子內含有共軛雙鍵,在280納米波長附近具有最大的光吸收峰。由于大多數蛋白質均含有酪氨酸、色氨酸殘基,所以測定蛋白質在280納米波長處的吸光度,是分析溶液中蛋白質含量的一種最快速簡便的方法。

      其優點是快速,對樣品無破壞,缺點在于此法是根據酪氨酸(Tyr),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp)殘基的強吸收值來測定的,不同的蛋白質其含量不同,所以當蛋白中缺乏這幾種氨基酸時,定量就不準了,就得考慮其他方法。另外核酸,和其他所有含有苯環共軛π鍵的物質(如蛋白洗脫用的咪唑)都會影響其定量,在測定前應先透析除去。

       

      一、如何利用微量分光光度計來測定蛋白濃度

      01  首先打開軟件,選擇Protein A280。

      02  再在右上角選擇樣品的類型,1Abs=1mg/ml為測定未知蛋白的選項(如果是測試抗體濃度,可以選擇igG預設參數,大部分廠家的設備都含有這個參數)。

      03  然后用純水將比色皿清洗三次,選擇合適的溶液作為背景,滴入2μl,按blank減去背景。再用純水將比色皿清洗三次,滴入2μl樣品,按measure測定。下方就會顯示樣品的A280值即為濃度。

      04  到這一步還沒完!

      還需要到https://web.expasy.org/protparam/,上輸入蛋白的序列來查找消光系數,用測得的A280除以該蛋白的消光系數,才是最終的準確濃度。

      菲恩生物嚴格把控每一個生產的蛋白或抗體產品的質量,質控方面使用傳統的SDS-Page膠染色,對比標準品濃度的BSA蛋白,確定濃度和純度,同時參考全進口微量分光光度計以獲得最準確的數據,讓產品在純度和濃度上不會出現偏差。

      二、舉例菲恩生產蛋白驗證的過程的結果圖(DOG43為蛋白編號)

      01  12%SDS-PAGE驗證(其中BSA標準品為1mg,上樣10ul)

      02  DOG43蛋白序列進行分析,計算消光系數。

      03  微量分光光度計濃度測定結果。

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